當(dāng)臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療時(shí)，選擇哪個(gè)代次的干細(xì)胞治療更加合適，是經(jīng)常容易被問(wèn)及的。這些都是應(yīng)該思考和有待解決的問(wèn)題。我們都是知道，人分男女老少，而干細(xì)胞也有年輕和衰老之分，因此，細(xì)胞的代數(shù)是影響干細(xì)胞活性及臨床有效性、安全性的一個(gè)重要因素。

理論上講，細(xì)胞代數(shù)越靠前，干細(xì)胞的干性也越強(qiáng)。但是干細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，干細(xì)胞有從組織微環(huán)境到體外培養(yǎng)環(huán)境的一個(gè)調(diào)整和適應(yīng)過(guò)程，一部分不適應(yīng)的細(xì)胞會(huì)被淘汰，所以在前兩三代，干細(xì)胞基因組有著不穩(wěn)定的因素，可能不宜臨床應(yīng)用。

有研究顯示，通過(guò)核型分析發(fā)現(xiàn)，在前三代細(xì)胞中，干細(xì)胞存在異常核型的比例偏高。就如間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）而言，臨床應(yīng)用的最佳代數(shù)應(yīng)該在 4~6 代。

目前臨床研究中，MSC 應(yīng)用較為常見(jiàn)的來(lái)源骨髓、脂肪、臍帶、胎盤(pán)等，本文以臍帶、脂肪、胎盤(pán)這三類比較常見(jiàn)的來(lái)源進(jìn)行總結(jié)，針對(duì)不同來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，體外傳代培養(yǎng)后不同代次的一些生物學(xué)特性的變化（例如：細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期檢測(cè)、表面標(biāo)記物檢測(cè)、染色體核型分析、相關(guān)基因表達(dá)及細(xì)胞因子的定量分析），因可供參考資料有限，不足之處請(qǐng)諒解。

細(xì)胞傳代

體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中的生長(zhǎng)過(guò)程主要分為 4 個(gè)階段（如下圖）：

首先是延滯期，細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶后，起始的一段時(shí)間內(nèi)是不增殖的，細(xì)胞數(shù)量保持不變。此階段，細(xì)胞需要時(shí)間來(lái)適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境；另外，進(jìn)行細(xì)胞分裂之前，細(xì)胞內(nèi)各成分（例如遺傳物質(zhì)）的復(fù)制與裝配等也需要時(shí)間。

過(guò)了延滯期后，細(xì)胞開(kāi)始分裂，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。此階段，細(xì)胞數(shù)量急速增加。

細(xì)胞數(shù)量增加到一定程度時(shí)，細(xì)胞相互接觸，產(chǎn)生接觸抑制，細(xì)胞分裂生長(zhǎng)速度減慢，直至完全停止生長(zhǎng)，進(jìn)入穩(wěn)定期。

進(jìn)入穩(wěn)定期后，由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，有害代謝產(chǎn)物積聚，細(xì)胞死亡數(shù)逐漸增加，進(jìn)入衰亡期。

因此，為了避免大規(guī)模細(xì)胞死亡，細(xì)胞在進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)應(yīng)及時(shí)消化，并重新接種到新的培養(yǎng)瓶中，這稱為細(xì)胞傳代。

從胎盤(pán)、臍帶和脂肪其他組織中分離干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，稱為原代培養(yǎng)，這一階段的細(xì)胞為原代細(xì)胞（0 代）。原代細(xì)胞充滿后，將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，這是第 1 代。在第 1 代細(xì)胞長(zhǎng)滿后，將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，這是第 2 代；第 2 代細(xì)胞充滿后，將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，即第 3 代細(xì)胞，依此類推。

胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞

足月胎盤(pán)是胎兒出生后的廢物，易于獲取，數(shù)量大，體積大，研究成本低，不涉及社會(huì)、倫理等問(wèn)題。此外，胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞具有與骨髓間充質(zhì)細(xì)胞相似的功能和特性，并且在增殖方面優(yōu)于骨髓間充干細(xì)胞，可以大大增加間充質(zhì)造血干細(xì)胞的數(shù)量。

一些研究分別測(cè)試了第 5、第 10 和第 15 代細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明，第 5 代間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力顯著高于第 10 和第 15 代細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞會(huì)隨著細(xì)胞代次的增加而逐漸老化。由于第 5 代后胎盤(pán)干間充質(zhì)細(xì)胞的增殖能力會(huì)逐漸下降，因此最好選擇第 5 代以下的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，作為臨床應(yīng)用。

注：胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞鏡下形態(tài)

圖 A 為細(xì)胞貼壁后形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，平行或漩渦狀生長(zhǎng)（×100）；

圖 B 為第 25 代細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石樣改變（40×4）。

注：胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、增殖能力及傳代結(jié)果

圖 A 為第 5 代細(xì)胞的倍增時(shí)間明顯短于第 10 代和第 15 代細(xì)胞的倍增時(shí)間；

圖 B 為不同代次的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力不同，第 5 代增殖能力明顯高于第 10 和第 15 代，與第 5 代比，aP<0.01，bP<0.001，與第 10 代比，c<0.05；

圖 C 為胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞 5 例標(biāo)本傳至 25 代，無(wú)貼壁細(xì)胞或貼壁不牢，但增殖速度快。

在這項(xiàng)研究中，胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞可以長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)到第 25 代。不同代次的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力不同，第 5 代的增殖能力顯著高于第 10 代和第 15 代，這表明在臨床應(yīng)用前使用第 5 代是合適的。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

在各種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞中，人臍帶源性間充質(zhì)細(xì)胞（hUC-MSCs）作為一種更“年輕”的成人間充質(zhì)造血干細(xì)胞，因其綜合優(yōu)勢(shì)而受到越來(lái)越多的關(guān)注。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，如細(xì)胞表面免疫標(biāo)記物和誘導(dǎo)的多潛能分化潛能，在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)后沒(méi)有顯著變化。長(zhǎng)期培養(yǎng) 20 代后，未發(fā)現(xiàn)致病或致瘤基因變異。高傳代（P20）hUC-MSCs 與早期低傳代（P5）hUC-MSCs 的細(xì)胞增殖活性和端粒酶活性無(wú)顯著差異。隨著培養(yǎng)傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞開(kāi)始老化，尤其是第 20 代細(xì)胞。

注：不同代次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

hUC-MSCs 在體外培養(yǎng)的第 5 代和第 10 代中顯示出相同的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)模式，顯示出長(zhǎng)梭狀貼壁生長(zhǎng)和輕微螺旋流動(dòng)排列。第 20 代細(xì)胞表現(xiàn)出非常相似的長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，但細(xì)胞體略有擴(kuò)大，融合后局部排列紊亂。

已經(jīng)表明，盡管在高傳代培養(yǎng)中 hUC-MSCs 的核型保持穩(wěn)定，但在第 7 代中端粒酶活性將下降。通過(guò)檢測(cè)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性亞基基因的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)第 5 代、第 10 代和第 20 代 hUC- MSCs 的端粒酶活性沒(méi)有顯著差異；不同世代的細(xì)胞表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)和增殖曲線，表明它們的細(xì)胞增殖活性沒(méi)有差異。

注：不同代次人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖活性檢測(cè)

總之，盡管第 20 代 hUC-MSCs 仍然保持了與低代細(xì)胞相似的干細(xì)胞的生物學(xué)特性、基因穩(wěn)定性和生長(zhǎng)特性，但隨著傳代培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞開(kāi)始顯示出一定程度的老化。鑒于過(guò)度傳代導(dǎo)致的 hUC-MSCs 老化跡象，建議用于臨床干細(xì)胞治療的 hUC-MSCs 體外培養(yǎng)不應(yīng)超過(guò)第 10 代。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）是脂肪組織中的多能干細(xì)胞。它的免疫原性很低，體外擴(kuò)增相對(duì)容易。這些優(yōu)點(diǎn)使其在組織工程、創(chuàng)傷修復(fù)和基因治療中具有良好的應(yīng)用前景。

在一些研究中，ADSCs 在體外培養(yǎng)至第 1、第 3、第 5、第 7、第 10、第 14 和第 15 代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 ADSCs 傳代至第 7 代后，細(xì)胞的增殖速率開(kāi)始減慢，并且在 10 代后細(xì)胞的增殖速度顯著減慢。細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，保持穩(wěn)定。

注：細(xì)胞形態(tài)觀察

注：細(xì)胞因子定量分析

研究表明，脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)）的生物學(xué)和遺傳特性基本穩(wěn)定，在傳代至第 5 代期間沒(méi)有顯著變化。初步揭示，脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外傳代至第 5 代后可以安全使用。

從上述研究中不難看出，間充質(zhì)干細(xì)胞在理論上可以長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，但在臨床應(yīng)用中不建議選擇代次較高的干細(xì)胞。未在體外擴(kuò)增的 MSCs 是安全無(wú)害的，除非它們有一些遺傳缺陷，否則體外擴(kuò)增的最大風(fēng)險(xiǎn)是基因突變。一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)骨髓 MSC 在體外培養(yǎng)到第 18 代時(shí)，發(fā)生了基因突變和染色體異常。大量其他研究證實(shí)，只有當(dāng)體外培養(yǎng)代數(shù)過(guò)高（超過(guò) 10 代）時(shí)，MSC 才會(huì)導(dǎo)致染色體異常。

影響干細(xì)胞回輸安全性的另一個(gè)問(wèn)題是添加劑，例如使用無(wú)血清培養(yǎng)基代替動(dòng)物血清進(jìn)行培養(yǎng)；通過(guò)嚴(yán)格的無(wú)菌操作避免使用抗生素。然而，對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)中不可替代的成分，如胰蛋白酶，在回輸過(guò)程中嚴(yán)格檢查質(zhì)量以確保沒(méi)有殘留成分也是至關(guān)重要的。

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